Genom von Solanum americanus

Nature Genetics (2023)Diesen Artikel zitieren

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Kartoffel- (Solanum tuberosum) und Tomatenpflanzen (Solanum lycopersicon) erleiden schwere Schäden durch Kraut- und Knollenfäule, die durch den Oomyceten-Erreger Phytophthora infestans verursacht wird. Solanum americanum, ein Verwandter von Kartoffeln und Tomaten, ist weltweit verbreitet und die meisten Akzessionen sind äußerst resistent gegen Knollenfäule. Wir haben hochwertige Referenzgenome von vier S. americanum-Akzessionen generiert, 52 Akzessionen neu sequenziert und ein Pan-NLRom von S. americanum-Immunrezeptorgenen definiert. Wir haben außerdem nach Variationen bei der Erkennung von 315P gesucht. infestans RXLR-Effektoren in 52 Akzessionen von S. americanum. Mithilfe dieser genomischen und phänotypischen Daten haben wir drei NLR-kodierende Gene, Rpi-amr4, R02860 und R04373, geklont, die verwandte P. infestans RXLR-Effektoren PITG_22825 (AVRamr4), PITG_02860 und PITG_04373 erkennen. Diese genomischen Ressourcen und Methoden werden die Bemühungen unterstützen, Kartoffeln mit dauerhafter Kraut- und Knollenfäuleresistenz zu entwickeln, und können auf Krankheiten anderer Nutzpflanzen angewendet werden.

Kartoffeln gehören weltweit zu den am meisten konsumierten Nichtgetreide-Pflanzen. Allerdings reduzieren Schädlinge und Krankheiten die weltweiten Erträge um ~17 % (Ref. 1). Die Kartoffelfäule, die durch den Oomyceten-Erreger Phytophthora infestans2 verursacht wird, löste in den 1840er Jahren die Hungersnot in Irland aus und ist immer noch die schädlichste Krankheit für die weltweite Kartoffelproduktion1.

Die pflanzliche Immunität hängt von der Erkennung von Krankheitserregern sowohl durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) auf der Zelloberfläche als auch durch intrazelluläre Immunrezeptoren ab. Viele R-Gene gegen P. infestans (Rpi-Gene) wurden aus wilden Verwandten von Kartoffelarten kloniert, wie z. B. R2, R3a, R8, Rpi-blb1, Rpi-blb2 und Rpi-vnt1 aus Solanum demissum, Solanum Bulbocastanum und Solanum venturii3,4 ,5,6,7,8,9,10. Die meisten geklonten Rpi-Gene wurden jedoch von dem sich schnell entwickelnden Krankheitserreger besiegt.

P. infestans-Effektoren tragen ein Signalpeptid und ein RXLR-EER-Motiv (wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt). Im Referenzgenom von P. infestans (Stamm T30-4) wurden 563 RXLR-Effektoren vorhergesagt, was Screens zur Erkennung dieser Effektoren („Efectoromics“) in verschiedenen Pflanzen ermöglichte11,12.

Es wurden Referenzgenomsequenzen von Kartoffeln, Tomaten, Auberginen und Paprika bestimmt13,14,15,16. Es sind auch abgestufte Genomassemblierungen auf Chromosomenebene von heterozygoten diploiden und tetraploiden Kartoffeln verfügbar17,18,19. Es wurden auch Pangenomstudien an Nutzpflanzen, einschließlich Kartoffeln, durchgeführt, die Aufschluss über die umfangreiche genetische Variation dieser Arten geben20,21,22,23. Es wurden Sequenzerfassungsmethoden entwickelt, um pflanzliche NLR- (RenSeq) und PRR-Genrepertoires (RLP/KSeq) zu sequenzieren, die die genomische Komplexität und die Sequenzierungskosten reduzieren24,25,26. Diese Methoden haben zu vielen wichtigen Anwendungen geführt, wie z. B. AgRenSeq und der Definition des Pan-NLRome von Arabidopsis27,28.

Das diploide Solanum americanum ist äußerst resistent gegen Kraut- und Knollenfäule. Zuvor klonte unsere Gruppe Rpi-amr1 und Rpi-amr3 aus mehreren resistenten S. americanum-Akzessionen zusammen mit ihren verwandten Effektoren AVRamr1 und AVRamr3 (Ref. 25, 29, 30, 31).

Hier haben wir vier hochwertige Genome von S. americanum sequenziert und zusammengestellt, 52 Akzessionen neu sequenziert und das Pan-NLRome von S. americanum definiert. Wir haben außerdem 315 RXLR-Effektoren von P. infestans in 52 Akzessionen von S. americanum untersucht. Diese genomischen Ressourcen und Funktionsdaten führten zur schnellen Identifizierung von drei neuen NLR-kodierenden Genen, Rpi-amr4, R02860 und R04373, die für die Erkennung von PITG_22825 (AVRamr4), PITG_02860 bzw. PITG_04373 verantwortlich sind. Diese Studie enthüllt eine Effektor-Triggered-Immunity (ETI)-Interaktionslandschaft zwischen S. americanum und P. infestans, die es uns ermöglichen wird, mehr Rpi-Gene aus dem Genpool wilder Solanum-Arten zu klonen und unser Wissen über die Krautfäule-Resistenz bei wilden Verwandten von Solanum zu vertiefen Kartoffel. Das auf der Kartoffelgenomik basierende Design des Kartoffelgenoms, das sich neuartige Pflanzenzüchtungstechnologien zunutze macht32, wird dazu beitragen, bessere Kartoffelsorten mit dauerhafter Kraut- und Knollenfäuleresistenz zu entwickeln.

S. americanum ist eine weltweit verbreitete Solanaceae-Art, die gegen viele Krankheitserreger resistent ist, darunter P. infestans und Ralstonia solanacearum25,29,33. Vier S. americanum-Akzessionen SP1102, SP2271, SP2273 und SP2275 wurden aufgrund ihrer Variation in der Resistenz gegen Spätfäule für die Sequenzierung ausgewählt (ergänzende Abbildung 1a, b). Wir haben PacBio High-Fidelity-, Oxford Nanopore- und Illumina-Paired-End-Reads generiert und die Genome von SP1102, SP2271, SP2273 und SP2275 zu Contigs zusammengesetzt (Ergänzende Anmerkung 1). Wir haben auch Hi-C-Daten für SP1102, SP2271 und SP2273 generiert und die Contigs in 12 Pseudomolekülen verankert (Ergänzende Anmerkung 1 und ergänzende Abbildungen 2 und 3). Die Vollständigkeit dieser Assemblierungen wurde von BUSCO auf ~98,4 % (Einzelkopie und Duplikat) geschätzt, was auf die hohe Qualität der Genomassemblierung hinweist (ergänzende Abbildung 4a). Um Genmodelle zu annotieren, verwendeten wir EVidenceModeler- oder GeMoMa-Pipelines, um die Ab-initio-Vorhersage, homologiebasierte Annotation und Transkriptomnachweise für SP1102/SP2271 oder SP2273/SP2275 zu integrieren. Zusammenfassend haben wir für jedes S. americanum-Genom einen Durchschnitt von 34.193 Genmodellen mit einer durchschnittlichen BUSCO-Bewertung von 98, 1% (Einzelkopie und Duplikat) vorhergesagt (ergänzende Abbildung 4b und Tabelle 1).

Um die Entwicklung der S. americanum-Genome zu untersuchen, haben wir die repräsentativen Proteinsequenzen aus 15 Genomen geclustert, darunter die Genome von vier S. americanum-Akzessionen, vier Kartoffelakzessionen, drei Tomatenakzessionen, vier weiteren Solanaceae-Arten und einer Fremdgruppenart von Arabidopsis thaliana. in 33.115 Orthogruppen, aus denen wir außerdem 1.363 Einzelkopie-Orthogruppen identifizierten. Die Topologie des Artenbaums legt nahe, dass S. americanum eine Schwesterart des gemeinsamen Vorfahren von Kartoffeln und Tomaten ist und sich vor ca. 14,1 Millionen Jahren auseinander entwickelte (Ma; 95 % höchstes hinteres Dichteintervall, 11,7–17,2 Ma; Abb. 1a). im Einklang mit einem früheren Bericht, der auf Plastidensequenzen basiert34.

a, Phylogenetische Verwandtschaft von S. americanum und benachbarten Arten. Die rote Zahl gibt den Bootstrap jedes Knotens an. Die schwarze Zahl gibt die geschätzte Divergenzzeit (vor Millionen Jahren) an. Der Maßstabsbalken stellt die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen pro Stelle dar. b: Genomsyntenie von S. americanum, Kartoffel und Aubergine. Bänder zwischen Chromosomen zeigen syntenische Regionen. Große Chromosomenumlagerungen (>1 MB groß) sind orange markiert.

Quelldaten

Die Chromosomenumlagerung (CR) ist ein wichtiger evolutionärer Prozess35. Die Genomassemblierungen in Referenzqualität ermöglichten es uns, die Chromosomenentwicklung von S. americanum zu untersuchen. Wir beobachteten 45 große CRs (> 1 MB groß), die 26 Inversions- und 19 Interchromosomen-Translokationsereignisse zwischen dem S. americanum- und dem Kartoffelgenom umfassten (Abb. 1b und ergänzende Abb. 5). Im Gegensatz dazu wurden 67 große CRs (30 Inversionen und 37 Interchromosomentranslokationen) zwischen S. americanum und Aubergine gefunden (Abb. 1b). Bemerkenswerterweise waren CRs nicht gleichmäßig über das Genom verteilt. Auf Chromosom 2 zwischen S. americanum und Kartoffel wurde kein CR identifiziert, während auf Chromosom 11 11 CRs auftraten.

Strukturelle Variationen (SVs), einschließlich Insertionen, Deletionen, Duplikationen, Inversionen und Translokationen, verursachen und erhalten phänotypische Vielfalt36. Die Chromosomenanordnungen von drei S. americanum-Genomen ermöglichten die Analyse großer SVs (>1 MB groß). Unter Verwendung von SP1102 als Referenz identifizierten wir 56 große SVs in SP2271 (ergänzende Abbildung 6a), die sich auf ca. 256 MB des Referenzgenoms auswirkten. In SP2273 wurden jedoch nur 14 große SVs identifiziert, die ~ 54 MB des Referenzgenoms abdecken (ergänzende Abbildung 6b). Die meisten SVs befinden sich in einzelnen Contigs und werden von der Hi-C-Interaktionskarte unterstützt, was auf die hohe Zuverlässigkeit der SV-Identifizierung hinweist (ergänzende Abbildung 6c und ergänzende Tabelle 1). Die großen Unterschiede in der SV-Zahl zwischen den Genomen von S. americanum geben Aufschluss über ihre komplexe Evolutionsgeschichte. Wir haben die kleinen SVs (40 bp – 1 MB groß) unter den S. americanum-Genomen weiter charakterisiert und festgestellt, dass SVs möglicherweise zur unterschiedlichen Expression von 1.084 Genen zwischen SP1102- und SP2271-Blättern beitragen (Ergänzende Anmerkung 2 und ergänzende Abbildungen 7 und 8). .

Um die Vielfalt der NLR-Gene zu verstehen, wurde ein phylogenetischer Baum unter Verwendung der NB-ARC-Domäne der NLR-Proteine ​​von SP1102 erstellt (Abb. 2a) und die Position dieser NLR-Gene im SP1102-Genom in der physischen Karte visualisiert (Abb. 2b). . Wir fanden heraus, dass 71 % der SP1102-NLR-Gene in Clustern lagen und der Rest Singletons waren (Abb. 2c). Aufgrund der Komplexität von NLR-Genclustern erzeugen die meisten automatischen Annotationspipelines falsche Genmodelle37. Um bessere Modelle der NLR-Gene zu erstellen, haben wir die NLR-Gene 528, 579 und 524 aus den Genomen SP1102, SP2271 und SP2273 manuell annotiert, indem wir NLR-Annotator-Ergebnisse und cDNA-Sequenzdaten einbezogen haben (Abb. 2d). Als nächstes wurden Anwesenheits-/Abwesenheitspolymorphismen (P/A) von NLR-Genen bei S. americanum-Akzessionen verglichen (Abb. 2a). Darüber hinaus wurde ein Pan-NLRome erstellt, was darauf hindeutet, dass die Akzessionen in unserer Forschung repräsentativ für das NLR-Repertoire von S. americanum sind (Ergänzende Anmerkung 3 und ergänzende Abbildung 9).

a: Die NB-ARC-Domänen von S. americanum SP1102 wurden vom NLR-Annotator vorhergesagt und zur Generierung eines Maximum-Likelihood-Baums unter Verwendung von IQ-TREE mit dem JTT + F + R9-Modell verwendet. Bekannte NLR-Proteine ​​von Solanaceae-Arten wurden einbezogen (rot hervorgehoben). Die NLRs werden auf der Grundlage eines früheren Berichts29 in verschiedene Gruppen eingeteilt. Die RNL-, TNL- und NRC-Superklasse wird angezeigt. Als Außengruppe wurde CED-4 aus Caenorhabditis elegans verwendet. Das Expressionsprofil wird durch eine Heatmap (weiß bis rot) basierend auf den cDNA-RenSeq-Daten von SP1102 dargestellt. Der P/A-Polymorphismus von NLRs aus den drei anderen S. americanum-Genomen und SMRT-RenSeq-Assemblys von 16 zusätzlichen Akzessionen werden durch die Heatmap (weiß bis blau) dargestellt. Die Beitrittsreihenfolge von oben nach unten ist SP3409, SP3408, SP3406, SP3400, SP3399, SP3370, SP2360, SP2308, SP2307, SP2300, SP2298, SP2272, SP1123, SP1101, SP1034, SP1032, SP2275, SP2273 und SP2271 . Die fehlenden NLRs werden durch schwarze Blöcke dargestellt. Der Maßstabsbalken stellt die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen pro Stelle dar. b, Die physische Karte der NLR-Gene im SP1102-Genom. CNLs werden durch gelbe Blöcke dargestellt, TNLs werden durch rote Blöcke dargestellt und RNLs werden durch rosa Blöcke dargestellt. Auf dieser Karte sind einige funktionell charakterisierte NLR-Cluster aufgeführt. Einige zuvor gemeldete NLR-Cluster (NRC1, NRG1, R3, ADR1, NRC3, R1, RB, Rpi-vnt1, NRC2, Rpi-chc1, Rpi-amr1, NRC6, NRC4b, NRC5, NRC4a, Rpi-amr3, Gpa2) werden angezeigt in der physischen Karte. (c) Der Anteil von NLR-Singletons und NLRs in Clustern. d, Anzahl der manuell kuratierten NLR-Gene (roter Kreis) und die Anzahl der vom NLR-Annotator vorhergesagten NLR-Gene (gelber Kreis). Eine manuelle Kuration der NLR-Gene aus SP2275 wurde nicht durchgeführt. e, Phylogenie der NRC-Helfer-NLR-Familie. Die NRC-Homologen aus Kartoffel, Tomate und N. benthamiana sind jeweils orange, rot und grün markiert. Die NRC-Proteine ​​von S. americanum sind schwarz. Die Zahl gibt den Bootstrap jedes Knotens an. Der Maßstabsbalken stellt die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen pro Stelle dar. f: Die log10-transformierten TPM-Werte für NLR-Gene werden in fünf Gruppen eingeteilt und einige Homologe bekannter R-Gene werden notiert. Die NLR-IDs sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Wir untersuchten auch das Expressionsniveau der SP1102-NLR-Gene durch erneute Analyse der RenSeq-cDNA-Daten25. Die Transkripte pro Million (TPM)-Werte der NLR-Gene wurden mit einer Heatmap visualisiert (Abb. 2a). Viele bekannte NLR-Gene wurden relativ stark exprimiert, beispielsweise das Sensor-NLR Rpi-amr3 und die Helfer-NLRs ADR1, NRG1, NRC4a, NRC2 und NRC3 (Abb. 2f und Ergänzungstabelle 2). Viele Solanaceae-Coiled-Coil-NLRs (CC-NLRs oder CNLs) erfordern Helfer-NLR-NRCs, die phylogenetisch verwandt sind, und wir fanden heraus, dass etwa 50 % der S. americanum-NLRs innerhalb der NRC-Superklasse liegen (Abb. 2a). Um die NRC-Familie zu untersuchen, haben wir einen phylogenetischen Baum für die NRC-Gene erstellt. Wir fanden NRC1-, NRC2-, NRC3-, NRC4a- und NRC6-Homologe sowie zwei NRC5a-Homologe im S. americanum-Genom (Abb. 2b, e). Interessanterweise haben sich die NRC4b-Gene (sieben Homologe) im S. americanum-Genom im Vergleich zu Nicotiana benthamiana (zwei Homologe) erweitert (Abb. 2e). Zuvor haben wir berichtet, dass Rpi-amr3 und Rpi-amr1 NbNRC2/NbNRC3/NbNRC4 bzw. NbNRC2/NbNRC3 in N. benthamiana erfordern29,30. Allerdings fehlt NRC1 in N. benthamiana39. Um zu testen, ob NRC1 aus S. americanum die Rpi-amr1/Rpi-amr3-Funktion unterstützen kann, haben wir SaNRC1 aus SP1102 geklont und gezeigt, dass SaNRC1 die Rpi-amr3-, aber nicht die Rpi-amr1-Funktion in N. benthamiana nrc2/mc3/mc4-Knockout-Pflanzen aktiviert (Ergänzende Abbildung 10). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass unterschiedliche Mitglieder in verschiedenen Pflanzenarten NRC-Funktionen ermöglichen könnten.

Das S. americanum-Genom und das Pan-NLRome ermöglichten es uns auch, die Vielfalt der NLR-Gene zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Sequenzdiversität in NLR-Regionen signifikant höher war als in Nicht-NLR-Regionen (ergänzende Abbildung 11a), was mit einem früheren Bericht übereinstimmt . Darüber hinaus fanden wir eine umfangreiche Sequenzvielfalt und Variation der Kopienzahl innerhalb von NLR-Clustern. Beispielsweise variierte der Rpi-amr3-Locus stark zwischen den S. americanum-Genomen (ergänzende Abbildung 11b), was zeigt, dass für eine zuverlässige NLRome-Annotation hochwertige Genome erforderlich sind.

Zusammenfassend haben wir ein Pan-NLRom von 20 Akzessionen von S. americanum erstellt und die NLR-Gene aus drei Referenzgenomen manuell annotiert. Diese Ressource ist wichtig für die Untersuchung der NLR-Genevolution und erleichtert funktionelle Studien von ETI in S. americanum und anderen Solanaceae-Arten.

Es gibt 563 vorhergesagte RXLR-Effektoren im T30-4 P. infestans-Referenzgenom. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass es in S. americanum-Referenzgenomen etwa 550 NLR-Gene gibt (Abb. 2d). Um Eins-zu-eins-Effektor-Rezeptor-Wechselwirkungen aufzudecken und mehr Immunrezeptoren zu klonen, haben wir ~315 RXLR-Effektoren an 52 Akzessionen von S. americanum gescreent (Abb. 3). Basierend auf cDNA-PenSeq-Daten werden alle diese RXLR-Effektoren während der Besiedlung eines anfälligen Kartoffelblatts exprimiert31. Wir fanden heraus, dass fünf Effektoren bei den meisten Akzessionen von S. americanum (≥ 50) eine hypersensitive Reaktion (HR) auslösten, einschließlich Effektoren aus der AVRblb2-Familie, während 185 Effektoren bei keinem Akzessionsgebiet von S. americanum eine HR auslösten, 71 Effektoren wurden von weniger als erkannt Fünf S. americanum-Akzessionen und 54 Effektoren zeigten eine unterschiedliche Erkennung durch verschiedene S. americanum-Akzessionen. AVRamr1 (36/52) und AVRamr3 (43/52) wurden auch von verschiedenen Akzessionen von S. americanum weitgehend erkannt (Abb. 3). Die vier Referenzakzessionen SP2271, SP2275, SP1102 und SP2273 konnten 25, 18, 30 bzw. 30 RXLR-Effektoren erkennen, von denen 5, 3, 7 und 9 Effektoren in jeder Akzession spezifisch erkannt wurden (ergänzende Abbildung 12). Insbesondere war die Akzession SP2271 im DLA-Test (Detached Leaf Assay) anfällig für P. infestans, die Anfälligkeit war jedoch altersabhängig (ergänzende Abbildung 1b), und diese Akzession ist auf dem Feld resistent gegen Kraut- und Knollenfäule. Wie erwartet erkannte SP2271 AVRamr1 und AVRamr3 nicht. Wir fanden vorzeitige Stoppcodons sowohl in Rpi-amr1- als auch in Rpi-amr3-Homologen von SP2271. Interessanterweise lösten 25 RXLR-Effektoren HR in SP2271 aus. Diese RXLR-Effektorerkennungen könnten zur altersabhängigen Resistenz und Feldresistenz von SP2271 gegen Kraut- und Knollenfäule beitragen. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse die ETI-Landschaft von S. americanum gegen den Kraut- und Knollenfäule-Erreger.

Insgesamt 315 RXLR-Effektoren wurden vorübergehend in 52 Akzessionen von S. americanum exprimiert. Für die Heatmap wurde der HR-Index (2, starke HR; 1, schwache HR; 0, keine HR, NA, nicht verfügbar) verwendet. Diese Effektoren wurden an N. benthamiana30 gescreent und ihre Erkennungen sind in dieser Heatmap enthalten. Als Negativkontrolle wurde ein leerer PVX-Vektor und als Positivkontrolle die Koexpression von Rpi-amr3–HisFlag und AVRamr3–GFP verwendet. Die Akzessionen von S. americanum wurden auf der Grundlage des Stammbaums geordnet; SP3400 ist in diesem Baum nicht enthalten. Der Maßstabsbalken stellt die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen pro Stelle dar. Die Akzessionen von S. americanum wurden in vier Gruppen eingeteilt (graue oder gelbe Schattierung). Die vier Referenzakzessionen sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Die Effektoren wurden basierend auf dem gesamten HR-Index geordnet. Für jeden Effektor wird die Anzahl der reagierenden S. americanum-Akzessionen durch ein Balkendiagramm oben auf der Heatmap visualisiert. Für jede S. americanum-Akzession wird die Anzahl der erkannten Effektoren durch ein Balkendiagramm auf der rechten Seite der Heatmap visualisiert. Einige zuvor in dieser Studie charakterisierte oder erwähnte RXLR-Effektoren sind durch graue Pfeile gekennzeichnet.

Um die genetische Vielfalt in den S. americanum-Akzessionen in unserer Sammlung zu untersuchen, führten wir eine PCR-freie 150-bp-Paired-End-Sequenzierung für 52 S. americanum-Akzessionen bei 10-facher Abdeckung durch. Wir haben einen phylogenetischen Baum unter Verwendung aller genetischen SNPs erstellt und Auberginen, Kartoffeln und Tomaten als Außengruppen verwendet (Abb. 3 und ergänzende Abb. 13a). Struktur- und Inzuchtkoeffizientenwerte wurden ebenfalls analysiert (ergänzende Abbildung 13b, c). Die 52 Akzessionen lassen sich in vier Gruppen einteilen (Ergänzende Abbildung 13a). Allen sechs Akzessionen in Gruppe 1 fehlten Rpi-amr1 und Rpi-amr3, basierend auf dem Effektoromik-Screening (Abb. 3 und Ergänzungstabelle 3). SP2275 und SP1102 befanden sich in Gruppe 2 und SP2273 in Gruppe 3. Für Gruppe 4 war kein Referenzgenom verfügbar, wir haben jedoch SMRT-RenSeq-Assemblys für mehrere dieser Akzessionen generiert. Überraschenderweise waren vier Akzessionen (SP2303, SP2310, SP3393 und SP3051) nicht eng mit anderen Gruppen verwandt und hochgradig heterozygot (ergänzende Abbildung 13c), was darauf hindeutet, dass es sich möglicherweise um polyploide Arten wie Solanum nigrum handelt. Zwei weitere Akzessionen, SP3052 und SP3376, waren ebenfalls nicht eng mit den vier S. americanum-Gruppen verwandt und könnten zu einer anderen Solanaceae-Art gehören. Diese Resequenzierungsdaten könnten für genomweite Assoziationsstudien (GWAS) und die Entwicklung molekularer Marker verwendet werden.

Während des Effektoromik-Screenings fanden wir einen Effektor, PITG_22825, der HR in 28 von 52 Akzessionen von S. americanum auslöste (Abb. 3 und Ergänzungstabelle 3), einschließlich SP1102 und SP2271, aber nicht SP2298 (Abb. 4a). PITG_22825 ist ein RXLR-Effektor mit einem Signalpeptid und RQLR- und EER-Motiven, gefolgt von der Effektordomäne (Abb. 4a). Dieser Effektor hatte vor unserer cDNA-PenSeq-Studie31 keine Beachtung gefunden. Um das Gen zu kartieren, das seine Erkennung verleiht, wurde eine GWAS-Analyse durchgeführt und ein starkes Signal in einem NLR-Singleton identifiziert, das sich auf Chromosom 01 von SP1102 befindet (Abb. 2b und 4b). Dieses Gen kodiert für ein CNL, das zur phylogenetischen Gruppe CNL-13 Rpi-amr3 gehört (Abb. 2a), obwohl sich der Rpi-amr3-Gencluster auf Chromosom 11 befindet (Abb. 2b). Dies weist darauf hin, dass das Kandidatengen auf Chromosom 1 möglicherweise vom Rpi-amr3-Locus auf Chromosom 11 transloziert wurde, was wahrscheinlich ein weiteres schwächeres GWAS-Signal im Rpi-amr3-Cluster von Chromosom 11 erklärt (Abb. 4b). Basierend auf cDNA-RenSeq-Daten von SP1102 trägt das entsprechende NLR-Gen im Vergleich zu Rpi-amr3 ein zusätzliches Exon (Abb. 4b). Um dieses GWAS-Signal zu verifizieren, führten wir eine Bulk-Segregant-Analyse und Resistenzgenanreicherungssequenzierung (BSA-RenSeq) in einer segregierenden F2-Population von SP2271 x SP2298 durch (ergänzende Abbildung 14). Das auf PITG_22825 reagierende Gen von SP2271 wurde sowohl im SP2271- als auch im SP1102-Referenzgenom an derselben Position auf Chromosom 1 kartiert.

a, PITG_22825 ist ein RXLR-Effektor. 35S::PITG_22825 löst den Zelltod auf den Blättern von S. americanum SP2271 und SP1102 aus, nicht jedoch auf den Blättern von SP2298. b, Manhattan-Diagramm des GWAS der PITG_22825-Erkennung. Die mit der PITG_22825-Erkennung verbundenen SNPs befinden sich in einem NLR-Singleton sp1102chr01_nlr39; (roter Pfeil). c, HR-Assay von Kandidatengenen. Rpi-amr4-1102 und Rpi-amr4-2271 wurden allein oder gemeinsam mit den Konstrukten 35S::PITG_22825 oder 35S::AVRamr3-GFP in N. benthamiana-Blättern exprimiert. Rpi-amr4-2271 ist in N. benthamiana autoaktiv, aber bei gleichzeitiger Expression mit PITG_22825 war die HR stärker. Rpi-amr4-1102 erkennt insbesondere PITG_22825. Als Kontrolle wurde Rpi-amr3 verwendet. OD600 = 0,5. Für jedes Experiment wurden vier Blätter von zwei Pflanzen verwendet und drei biologische Replikate mit den gleichen Ergebnissen durchgeführt. HF, HisFlag. d, Phylogenie von Rpi-amr4-Homologen in verschiedenen S. americanum-Akzessionen. Rpi-amr3 wurde als Außengruppe verwendet. PITG_22825-vermittelte HR wird durch rote (HR) oder blaue (keine HR) Kreise angezeigt. Die prozentuale Identität der Aminosäuresequenz relativ zu Rpi-amr4-1102 wird angezeigt. a,c,d–f, Die Maßstabsbalken stellen die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen pro Stelle dar. e, Rpi-amr4-Knockout-Leitungen verlieren die Kapazität für die PITG_22825-Erkennung. Zwei sgRNAs (schwarze Pfeile) wurden auf Rpi-amr4-2271 entworfen. Dargestellt ist der Genotyp der beiden Knockout-Linien. Beide Linien erkannten PITG_22825 nicht, HR konnte jedoch ergänzt werden, wenn PITG_22825 gemeinsam mit Rpi-amr4-1102 exprimiert wurde. Als Kontrollpflanzen wurden Wildtyp (WT) SP2271-Pflanzen verwendet. Als Positivkontrolle wurden Rpi-amr3 und AVRamr3 verwendet. OD600 = 0,5. f, DLA mit 35S::Rpi-amr4-1102. 35S::Rpi-amr4-1102 (grün), Rpi-amr3 (positive Kontrolle, rot) und Rpi-amr3a (ein nicht funktionierendes Rpi-amr3-Paralog, negative Kontrolle, blau) wurden vorübergehend in N. benthamiana exprimiert, OD600 = 0,5. Zoosporen des P. infestans-Stammes T30-4 wurden zur Inokulation der Blätter 1 Tag nach der Infiltration (dpi) verwendet. Die Läsionsgrößen wurden mit 6 dpi gemessen. Es wurden vier biologische Replikate durchgeführt und alle Datenpunkte (74 Datenpunkte pro Behandlung) als Box-and-Whisker-Diagramm visualisiert. Mittellinie, Median; Boxgrenzen, oberes und unteres Quartil. Die Whisker (oben und unten) umfassen Werte innerhalb des 1,5-fachen Interquartilbereichs (IQR). Die Ausreißer sind durch schwarze Punkte gekennzeichnet. Statistische Unterschiede wurden durch eine einfache ANOVA mit Tukeys HSD-Test (P < 0,001) analysiert und durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet. Es werden repräsentative Blätter dargestellt.

Quelldaten

Um die Genfunktion zu testen, wurden die ORFs der Kandidatengene von SP2271 und SP1102 PCR-amplifiziert und in einen überexprimierenden binären Vektor mit dem 35S-Promotor und dem Ocs-Terminator kloniert. Die resultierenden Konstrukte wurden dann in Agrobacterium tumefaciens transformiert. Die Kandidatengene wurden in N. benthamiana allein oder zusammen mit PITG_22825 oder AVRamr3-GFP als Negativkontrolle exprimiert. Als Positivkontrolle wurde Rpi-amr3-HisFlag verwendet. Wir fanden heraus, dass das SP2271-Allel (im Folgenden Rpi-amr4-2271) in N. benthamiana autoaktiv war, aber wenn es zusammen mit PITG_22825 exprimiert wurde, war die HR im Vergleich zur Kontrolle schneller und stärker (Abb. 4c). Im Gegensatz dazu war das SP1102-Allel (im Folgenden Rpi-amr4-1102) in N. benthamiana nicht autoaktiv. HR wurde ausgelöst, als Rpi-amr4-1102 zusammen mit PITG_22825 exprimiert wurde, nicht jedoch AVRamr3-GFP (Abb. 4c). Es gibt nur drei Aminosäureunterschiede zwischen den von Rpi-amr4-1102 und Rpi-amr4-2271 kodierten Proteinen, und diese Unterschiede könnten die Autoaktivität des SP2271-Allels verursachen (ergänzende Abbildung 15). Wir fanden auch heraus, dass Rpi-amr4 in den auf PITG_22825 reagierenden Akzessionen konserviert war (Abb. 4d). Um die Funktion von Rpi-amr4 zu überprüfen, haben wir mit CRISPR-Cas9 Rpi-amr4-knockout SP2271-Linien generiert. Insgesamt wurden 16 CRISPR-Cas9-Knockout-Linien generiert (Ergänzungstabelle 4) und 2 Linien sind in Abb. 4e dargestellt. Der Wildtyp SP2271 konnte PITG_22825 erkennen, die Rpi-amr4-Knockout-Linien jedoch nicht. Der HR-Phänotyp konnte ergänzt werden, wenn Rpi-amr4-1102 mit PITG_22825 in den Knockout-Linien coexprimiert wurde (Abb. 4e). Daher schließen wir, dass Rpi-amr4 den PITG_22825-erkennenden Immunrezeptor kodiert und dass PITG_22825 Avramr4 ist.

Um zu testen, ob Rpi-amr4 Resistenz gegen Spätfäule verleiht, haben wir Rpi-amr4-1102 vorübergehend in N.-benthamiana-Blättern exprimiert und die Blätter mit P.-infestans-Zoosporen inokuliert. Als Positivkontrolle wurde Rpi-amr3 und als Negativkontrolle nicht funktionierendes Rpi-amr3a aus SP1102 verwendet (Abb. 4f). Dieser Test zeigte, dass Rpi-amr4-1102 Resistenz gegen das P. infestans-Isolat T30-4 verleiht. Allerdings war der Widerstand schwächer als bei Rpi-amr3 (Abb. 4f). Wir haben auch stabile transgene Rpi-amr4-1102-N.-benthamiana-Linien generiert. Wie erwartet erlangten die transgenen T0-Pflanzen die Fähigkeit zur Erkennung von PITG_22825 und waren resistent gegen zwei P. infestans-Isolate T30-4 und 88069. Wir haben diesen Befund auch in den transgenen T1-Rpi-amr4-Linien überprüft (ergänzende Abbildung 16a, b). .

Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein neues Rpi-Gen Rpi-amr4 aus S. americanum geklont und sein zugehöriges Effektorgen Avramr4 (PITG_22825) definiert. Rpi-amr4 verleiht Resistenz gegen Kraut- und Knollenfäule und kann als Ressource für die Produktion von gegen Kraut- und Knollenfäule resistenten Kartoffeln dienen.

Obwohl Rpi-amr4 mithilfe eines GWAS-Ansatzes identifiziert werden konnte, war die Anzahl der von einigen Akzessionen von S. americanum erkannten Effektoren gering und ermöglichte kein klares GWAS-Signal. Wir haben daher BSA-RenSeq eingesetzt, um zwei weitere Immunrezeptoren zu klonen.

PITG_02860 (Abb. 5a) zielt auf das Wirtsprotein NRL1 ab, schwächt die pflanzliche Immunität und erhöht die Virulenz des Krankheitserregers, der entsprechende Rezeptor war jedoch unbekannt40. Wir fanden heraus, dass PITG_02860 bei 5 von 52 Akzessionen von S. americanum, einschließlich SP2271, HR auslöste. Wir haben eine F2-Population von SP2271 (PITG_02860 responsiv, R) × SP2272 (PITG_02860 nicht responsiv, NR) getestet und festgestellt, dass die Erkennung von PITG_02860 gemäß einem Verhältnis von 3:1 (104 R und 34 NR; χ2 (1, Ν) getrennt war = 138) = 0,00966, P = 0,92169) (Abb. 5b). Die RenSeq-Pipeline wurde an der F2-Population durchgeführt und die meisten gefilterten SNPs befanden sich in einer 1-MB-Region oben auf Chromosom 4 von SP2271 (Abb. 5c). SCAR-Marker wurden auf der Grundlage der Resequenzierungsdaten entworfen und zur Genotypisierung verwendet. Das Kandidatengen wurde auf eine 295 kb große Region zwischen den Markern S42 und S36 kartiert. Sieben NLRs-Gene liegen innerhalb des Kartierungsintervalls und gehören alle zur R3-Familie (Abb. 2a, b und 5c). Um diese Kandidatengene zu testen, wurden die ORFs von vier Kandidatengenen (nlr13, nlr14, nlr16, nlr17) unter der Kontrolle des 35S-Promotors und des Ocs-Terminators in einen binären Vektor kloniert und zur vorübergehenden Expression in Agrobacterium transformiert. Die Kandidatengene wurden allein oder mit PITG_02860 oder AVRamr3 in N. benthamiana und Nicotiana tabacum exprimiert. NLR16 und NLR17 waren in N. benthamiana autoaktiv, wir fanden jedoch, dass die Koexpression von NLR16 und PITG_02860 HR in N. tabacum aktivierte (Abb. 5d). Um diesen Befund zu überprüfen, haben wir mithilfe des CRISPR-Cas9-Systems nlr16-Knockout-SP2271-Linien generiert. Wie erwartet verloren die Knockout-Linien die Erkennung von PITG_02860 (ergänzende Abbildung 17). Daher schließen wir, dass NLR16 (im Folgenden R02860) der Immunrezeptor für PITG_02860 ist.

a, PITG_02860 ist ein RXLR-Effektor von P. infestans. Es werden eine Illustration und eine vorhergesagte Struktur angezeigt. b: Eine F2-Population wurde aus einer Kreuzung zwischen SP2271 (reagiert auf PITG_02860, R) und SP2272 (keine Reaktion auf PITG_02860, NR) generiert. Für BSA-RenSeq wurden der R-Bulk (104 Nachkommen) und der NR-Bulk (34 Nachkommen) verwendet. c: Insgesamt wurden 218 verknüpfte SNPs (rote Punkte) auf der Oberseite von Chromosom 4 von SP2271 identifiziert. Der graue Balken stellt das Chromosom dar. Die physischen Positionen (in MB) werden nach Nummer angezeigt. Für die kartenbasierte Klonierung wurden fünf molekulare Marker (S30, S42, S35, S36 und S31) verwendet. Die Anzahl der Rekombinationsereignisse pro insgesamt getesteten Gameten wird angezeigt. d, HR-Assay des Kandidaten-Rezeptors PITG_02860. Die Kandidatengene wurden allein oder gemeinsam mit PVX::PITG_02860 in N. tabacum-Blättern exprimiert. Als Kontrollen wurden Rpi-amr3 und AVRamr3 verwendet. Es stellte sich heraus, dass NLR16 der PITG_02860-Rezeptor (im Folgenden R02860) war. OD600 = 0,5. Es wurden vier Wochen alte N. tabacum-Pflanzen verwendet und die Fotos wurden mit 4 dpi aufgenommen. Drei biologische Replikate wurden mit den gleichen Ergebnissen durchgeführt. e, PITG_04373 ist ein RXLR-Effektor von P. infestans. Es werden eine Illustration und eine vorhergesagte Struktur angezeigt. f: Sowohl Rückkreuzungspopulationen (BC1) als auch F2-Populationen wurden aus SP2271 und SP2300 generiert. Die BC1-Population von 192 reagierenden Pflanzen und 182 nicht reagierenden Nachkommen wurde für BSA-RenSeq gebündelt. Die F2-Populationen wurden zur Feinkartierung verwendet. g: Es wurden informative SNPs (rote Punkte) oben auf Chromosom 10 von SP2271 identifiziert. Für die Feinkartierung wurden fünf molekulare Marker (S11, S13, S5, S7 und S16) verwendet. Die Anzahl der Rekombinationsgameten pro insgesamt getesteten Gameten wird angezeigt. Neun Gene aus SP2300-SMRT-RenSeq-Assemblys, die dem Kartierungsintervall des SP2271-Genoms zugeordnet waren, wurden als Kandidatengene angesehen. Mit Ausnahme von C444 gehören alle Kandidaten zur Rpi-chc1-Familie. h, HR-Assay der PITG_04373-Rezeptorkandidaten. Die Kandidatengene wurden allein oder zusammen mit 35S::PITG_04373 in N. benthamiana-Blättern exprimiert, Rpi-amr3 und AVRamr3 wurden als Kontrollen verwendet. Es stellte sich heraus, dass C168 der PITG_04373-Rezeptor (im Folgenden R04373) war. OD600 = 0,5. Es wurden vier Wochen alte N. benthamiana-Pflanzen verwendet und Fotos mit 4 dpi aufgenommen. Drei biologische Replikate wurden mit den gleichen Ergebnissen durchgeführt.

PITG_04373 (Abb. 5e) löste HR in nur 3 von 50 Akzessionen von S. americanum aus, einschließlich in SP2300, das sowohl funktionelles Rpi-amr1 als auch Rpi-amr3 trägt (Abb. 3). Um das entsprechende Immunrezeptor-Gen zu klonen, haben wir zunächst eine BC1-Rückkreuzungspopulation von SP2271 (NR) × SP2300 (R) phänotypisiert. Die BC1-Population trennte sich hinsichtlich der Reaktionsfähigkeit von PITG_04373 mit einem Verhältnis von 1:1 (198 R und 182 NR; χ2 (1, N = 380) = 0,67368, P = 0,41177) (Abb. 5f). Die DNA von reagierenden oder nicht reagierenden Nachkommen wurde für BSA-RenSeq gebündelt und die meisten verknüpften SNPs wurden auf SP2271-Chromosom 10 kartiert (Abb. 5g). Es wurden SCAR-Marker entworfen und eine F2-Population von SP2271 × SP2300 phänotypisiert und genotypisiert. Die Reaktionsfähigkeit von PITG_04373 wurde auf ein 1,447-MB-Intervall mit acht Genen basierend auf dem SP2271-Genom abgebildet (Abb. 5g). Die meisten Kandidaten gehören zur Rpi-chc1-Familie, mit Ausnahme eines R1-Homologs (Abb. 5g). In Ermangelung eines Referenzgenoms für SP2300 verwendeten wir die SMRT-RenSeq-Assembly als Referenz-NLRome29. Die SMRT-RenSeq-Contigs, die dieser Region des SP2271-Genoms zugeordnet wurden, und Kandidatengene von SP2300 wurden für transiente Tests in einen Vektor mit dem 35S-Promotor und dem Ocs-Terminator kloniert. Fünf Kandidatengene wurden getestet (C18.1, C18.2, C127, C168 und C829). Wir fanden heraus, dass der Kandidat für den Immunrezeptor C168 (im Folgenden R04373) PITG_04373 nach vorübergehender Expression in N. benthamiana spezifisch erkennen kann (Abb. 5h). Daher schließen wir, dass R04373 der Immunrezeptor von PITG_04373 ist.

SP2300 trägt auch funktionelle Rpi-amr1- und Rpi-amr3-Homologe. Um die Funktion von R04373 in SP2300 zu testen, haben wir dreifache Knockout-Linien Rpi-amr1-2300/Rpi-amr3-2300/R04373 generiert (ergänzende Abbildung 18a). Es wurden vierzig transgene SP2300-Knockout-Linien erzeugt und phänotypisiert, und 13 dieser 40 Knockout-Linien verloren die Erkennung der drei Effektoren (PpAVRamr1, AVRamr3 und PITG_04373). Zwei dieser Linien, SLJ25603#3 und SLJ25603#17, wurden genotypisiert und die Knockout-Ereignisse wurden bestätigt (ergänzende Abbildung 18b – e). Wir haben auch R04373 zusammen mit PITG_04373 exprimiert; Allerdings wurde der HR-Phänotyp in diesen Knockout-Linien nicht wiederhergestellt (ergänzende Abbildung 18e) und wir stellten die Hypothese auf, dass das verkürzte R04373-Fragment störende RNAs produzieren könnte. Interessanterweise zeigten die Triple-Knockout-Linien im Vergleich zum Wildtyp-SP2300 eine leicht erhöhte Anfälligkeit für P. infestans (ergänzende Abbildung 18f, g), waren jedoch resistenter als SP2271, was darauf hindeutet, dass SP2300 zusätzliche Rpi-Gene enthält.

Um die durch R02860 und R04373 verliehene Krautfäule-Resistenz zu testen, exprimierten wir vorübergehend R02860, R04373, Rpi-amr4 und ihre Kombinationen in N. benthamiana und maßen das Wachstum von P. infestans. Obwohl wir nach der vorübergehenden Expression von R02860 und R04373 eine leichte, signifikante Abnahme der Läsionsgröße beobachteten, konnte der Erreger die Pflanzen dennoch infizieren. Wir haben Rpi-amr4 auch zusammen mit R02860 oder R04373 exprimiert, ohne die Resistenz von Rpi-amr4 zu erhöhen (ergänzende Abbildung 19). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass R02860 und R04373 zwar die RXLR-Effektoren PITG_02860 und PITG_04373 von P. infestans erkennen können, die von ihnen verliehene Resistenz jedoch von P. infestans überwunden werden kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir mithilfe von BSA-RenSeq, SMRT-RenSeq und kartenbasierten Klonierungsstrategien erfolgreich zwei neue Immunrezeptoren, R02860 und R04373, geklont und ihre anerkannten RXLR-Effektoren, PITG_02860 und PITG_04373, definiert haben.

Solanum ist die größte Gattung der Familie der Nachtschattengewächse und umfasst mehr als 1.500 Arten, darunter viele wichtige Nutzpflanzen wie Kartoffeln, Tomaten und Auberginen, für die umfangreiche Genomsequenzdaten verfügbar sind. Der S. nigrum-Komplex besteht aus vielen Arten mit unterschiedlichen Ploidieniveaus, darunter S. nigrum (6×), Solanum scabrum (6×), Solanum villosum (4×) und S. americanum (2×). Einige gelten als Unkraut, andere werden in verschiedenen Ländern als Nahrungsmittel und Arzneimittel konsumiert41. Wichtig ist, dass diese Arten über wertvolle genetische Variationen für die Resistenz gegen Krankheiten verfügen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kartoffelfäule und Bakterienwelke25,29,31. In dieser Studie haben wir vier S. americanum-Genome sequenziert und zusammengestellt und Multi-Omics-Datensätze generiert. Diese Daten ermöglichten es uns, ein S. americanum-Pan-NLRome aufzubauen, um die Entwicklung und Funktion der NLR-Gene in S. americanum zu untersuchen.

Die Kraut- und Knollenfäule der Kartoffeln löste in den 1840er Jahren die Hungersnot in Irland aus und stellt nach wie vor eine globale Herausforderung dar, die die Kartoffelproduktion stark einschränkt. Um die ETI von S. americanum bis P. infestans zu verstehen, verwendeten wir „Effektoromik“, um die ETI-Wechselwirkungen zwischen ihnen zu analysieren. Wir haben eine Matrix aus 315 RXLR-Effektoren × 52 S. americanum-Akzessionen erstellt. Interessanterweise ist die Erkennung von AVRamr1 (36/52) und AVRamr3 (43/52) in Akzessionen von S. americanum weit verbreitet, was darauf hindeutet, dass Rpi-amr1 und Rpi-amr3 eine wichtige Rolle bei der Kraut- und Knollenfäuleresistenz von S. americanum spielen. Dieser Befund steht im Einklang mit den Schlussfolgerungen einer pangenomischen ETI-Studie zur Interaktion zwischen Arabidopsis und Pseudomonas syringae42. Einige Effektoren induzieren den Zelltod in allen Akzessionen von S. americanum, beispielsweise Effektoren der AVRblb2-Familie (Abb. 3). Diese Beobachtung steht im Einklang mit früheren Erkenntnissen, dass AVRblb2 (PexRD39/PexRD40) den Zelltod bei allen getesteten Wildkartoffelarten induziert, nicht jedoch bei N. benthamiana43,44; Dieser unspezifische Zelltod könnte auf die Virulenzaktivitäten von AVRblb2 zurückzuführen sein. Einigen resistenten Akzessionen fehlt die Erkennung von AVRamr1 und AVRamr3 und sie sind daher wertvolle Quellen für neuartige Rpi-Gene.

In dieser Studie wurden drei neue Immunrezeptoren Rpi-amr4, R02860 und R04373 kloniert (Abb. 4 und 5). Wir haben gezeigt, dass Rpi-amr4 die P. infestans-Resistenz in N. benthamiana erhöht. Es wurde berichtet, dass PITG_02860 die Anfälligkeit des Wirts fördert, indem es auf das Wirtsprotein NRL1 abzielt (Lit. 40), und die Virulenzfunktionen und Wirtsziele von AVRamr4 und PITG_04373 müssen noch entdeckt werden. P. infestans ist ein sich schnell entwickelnder Krankheitserreger und könnte innerhalb weniger Jahre in der Lage sein, einzelne Rpi-Gene im Feld zu überwinden. Resistenzen, die auf der Erkennung eines einzelnen Effektors basieren, können leicht durch Mutationen oder Stummschaltung überwunden werden, wie für Avrvnt1 gezeigt (Ref. 45, 46). R-Gen-Stacking ist eine bessere Möglichkeit, geklonte R-Gene im Feld einzusetzen47,48. Daher kann Rpi-amr4 mit anderen Rpi-Genen gestapelt werden, um eine stärkere und dauerhaftere Resistenz gegen Kartoffelfäule zu erreichen.

Die beiden anderen Immunrezeptoren R02860 und R04373, die PITG_02860 und PITG_47373 erkennen, wurden aus SP2271 bzw. SP2300 kloniert. Die durch diese Gene verliehene Resistenz ist möglicherweise zu schwach, um im Feld eingesetzt zu werden (ergänzende Abbildung 19). Viele Effektoren unterdrücken die Wirtsimmunität, insbesondere AVRcap1, das die Funktion der Helfer-NLRs NRC2 und NRC3 abschwächen kann (Lit. 49). Diese Abschwächung könnte erklären, warum einige pflanzliche Immunrezeptoren, die Effektoren erkennen, dennoch keine starke Krankheitsresistenz verleihen. Um die komplexe Natur der Wechselwirkung zwischen Pflanzen und Krankheitserregern zu verstehen, stellt unsere Arbeit einen Assay zur künftigen Identifizierung des Suppressors von R02860 und R04373 bereit.

Zusammenfassend stellt unsere Studie wertvolle genomische und genetische Werkzeuge bereit, die den Weg zum Verständnis und zur Erzielung einer dauerhaften Resistenz gegen Kartoffelfäule und andere Pflanzenkrankheiten beschleunigen sollen und zeigt, dass S. americanum eine hervorragende Modellpflanze zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen ist Immunität.

Vier repräsentative S. americanum-Akzessionen, SP1102, SP2271, SP2273 und SP2275, wurden für die Sequenzierung ausgewählt. Die Pacific Bioscience Sequel II-Plattform im CCS-Modus (Circular Consensus Sequencing) wurde zur Sequenzierung der Genome von SP1102 und SP2271 eingesetzt und generierte 30,5 GB bzw. 28,5 GB High-Fidelity-Reads (HiFi). Die PromethION- und GridION-Plattformen von Oxford Nanopore Technologies wurden zur Sequenzierung der Genome von SP2273 und SP2275 eingesetzt und generierten jeweils etwa 81,1 GB und etwa 114,5 GB an Daten. Um die Heterozygotie des Genoms abzuschätzen und die Rohgenome zu polieren, haben wir auch Bibliotheken für die Illumina-Paired-End-Short-Reads-Sequenzierung nach dem Standardprotokoll vorbereitet und mit dem Illumina Hiseq 2500 durchschnittlich 99,2 GB saubere Daten für jede S. americanum-Akzession generiert Plattform. Hi-C-Bibliotheken der drei Akzessionen von S. americanum, SP1102, SP2271 und SP2273, wurden aus jungen Sämlingen auf Basis des Restriktionsenzyms MboI erstellt. Die Illumina Hiseq 2500-Plattform wurde eingesetzt, um 86,5, 81,8 und 54,8 GB Paired-End-Lesevorgänge für SP1102, SP2271 und SP2273 zu generieren.

Die Genomgröße und Heterozygotie wurden mithilfe eines k-mer-basierten Ansatzes von KAT50 und GenomeScope51 geschätzt. Die geschätzte Genomgröße wurde als Gesamtzahl der k-mere dividiert durch die geschätzte Sequenzierungsabdeckung berechnet. Die Gesamtzahl der k-mer könnte aus Sequenzierungsdaten berechnet werden, und die Sequenzierungsabdeckung könnte basierend auf der k-mer-Verteilungshäufigkeit beurteilt werden. In dieser Studie haben wir KAT angewendet, um die k-mer-Häufigkeit mit k = 19 zu berechnen, und das Perl-Skript „estimate_genome_size.pl“ (https://github.com/josephryan/estimate_genome_size.pl) zur Schätzung der Genomgröße von S. americanum. Hifiasm52 wurde angewendet, um SP1102 und SP2271 de novo unter Verwendung von Standardparametern zusammenzustellen. Um die Genome von SP2273 und SP2275 zusammenzustellen, haben wir zunächst ONT-Lesevorgänge mit Canu53 mit den Parametern „correct corOutCoverage=500 corMinCoverage=2 minReadLength=2000 genomeSize=1g -nanopore-raw“ korrigiert. Die korrigierten Lesevorgänge wurden dann von SMARTdenovo54 mit den folgenden Befehlszeilenargumenten zu Roh-Contigs zusammengesetzt: „perl smartdenovo.pl -c 1 -t 24 -k 17“. Die Rohbaugruppen wurden dann mithilfe von Illumina-Kurzlesevorgängen iterativ poliert. Die Lesevorgänge wurden mit BWA55 an den Rohbaugruppen ausgerichtet und die resultierenden BAM-Dateien wurden zum Polieren an Pilon56 übergeben. Pseudochromosomen wurden mithilfe der Juicer57- und 3d-DNA58-Pipeline mit den Parametern „-m haploid -i 15000 -r 0“ erstellt. Die Qualität der Baugruppen wurde von BUSCO (Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs)59 mit der Datenbank solanales_odb10 bewertet.

Für SP1102 und SP2271 wurden zur Unterstützung der Genmodellvorhersage die Transkriptome ganzer Sämlinge, Wurzeln, Stängel, Blätter, Blüten und Früchte von S. americanum mithilfe der Illumina HiSeq 2500-Plattform mit drei Replikationen für jedes Gewebe und 4 GB sauberem Material sequenziert Daten für jede Probe. Die Lesevorgänge wurden von HISAT60 mit dem Genom abgeglichen, die Transkripte wurden mit StringTie61, Cufflinks62 und Trinity63 zusammengesetzt und die Assemblierungen wurden dann zur Vorhersage proteinkodierender Gene in PASA64 importiert. Ab-initio- und homologe Proteinsuchstrategien wurden auch unter Verwendung von SNAP65, AUGUSTUS66, GlimmerHMM67 und exonerate68 durchgeführt. Alle vorhergesagten Beweise wurden mithilfe von EVM64 integriert. Um Genmodelle in SP2273 und SP2275 vorherzusagen, verwendeten wir die Datensätze ITAG4.0 (Ref. 14) und SolTub_3.0 (Ref. 13) für die homologiebasierte Genvorhersage im GeMoMa-Programm69. Von SP2273 erhaltene RNA-Seq-Daten wurden ebenfalls zur Vorhersage der Spleißstelle einbezogen.

Die repräsentativen Proteinsequenzen von Arabidopsis thaliana, Petunia inflata, Capsicum annuum, Solanum melongena, Solanum tuberosum Gruppe Phureja (DM1-3 516 R44), S. tuberosum Gruppe Tuberosum (RH89-039-16), Solanum commersonii, Solanum chacoense, Solanum pennellii , Solanum pimpinellifolium, Solanum lycopersicum und vier S. americanum-Akzessionen (SP1102, SP2271, SP2273 und SP2275) wurden extrahiert und in OrthoFinder70 eingegeben, um mithilfe des MCL-Algorithmus Orthogruppen zu gruppieren. Die Proteinsequenzen von 1.363 Einzelkopie-Orthogruppen wurden extrahiert, um die phylogenetische Verwandtschaft nach der Supermatrix-Methode abzuleiten. Sequenzen aus 15 Genomen wurden mit MAFFT71 mit dem Parameter „--auto“ abgeglichen und mit trimAl mit den Parametern „-phylip -gt 0.8“ getrimmt. IQ-TREE72 wurde angewendet, um die phylogenetischen Beziehungen mit den Parametern „--alrt 1000 -B 1000“ abzuleiten. Wir haben BASEML und MCMCTREE aus dem PAML-Softwarepaket73 verwendet, um die Divergenzzeit abzuschätzen. Die Codierungssequenzsequenzen (CDS) von 1.363 Einzelkopie-Orthogruppen wurden für eine grobe Schätzung der Substitutionsrate mithilfe von BASEML mit Modell = 7 extrahiert. MCMCTREE mit den Parametern „Modell = 7, Burnin = 5.000.000, Sampfreq = 300, Nsample = 20.000“ wurde angewendet, um die Divergenzzeit abzuschätzen. Zur Kalibrierung wurden die Divergenzzeiten von Kartoffel-Tomate (7–10 Ma)34 und Kartoffel-Arabidopsis (111–131 Ma; http://www.timetree.org/) verwendet. Es wurden zwei Schätzrunden mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Das genomische Alignment zwischen SP1102 und Aubergine/Kartoffel wurde mit MUMMER74 mit den Parametern „--maxmatch -c 100 -b 500 -l 50“ durchgeführt. Die Ausrichtung wurde mit den Parametern „-1 -i 80 -l 100“ weiter gefiltert. Das Delta-Format wurde dann mit dem Skript paftools.js75 in das PAF-Format konvertiert und zur Punktdiagramm-Visualisierung an D-Genies76 übergeben.

Wir haben das Python-basierte Programm MCscan (v1.1.8) (Ref. 77) verwendet, um die syntenische Analyse durchzuführen. Die repräsentativen Proteinsequenzen und entsprechenden Genmodellanmerkungen im BED-Format von Kartoffel- (DMv6.1), Auberginen- (HQ-1315) und vier S. americanum-Genomen wurden extrahiert, um nach Homologen mit den Parametern '-m jcvi.compara.catalog ortholog - zu suchen. -cscore = .99'. Syntenische Regionen wurden mit „-m jcvi.compara.synteny screen --minspan=30“ identifiziert und mit den Parametern „-m jcvi.graphics.karyotype“ visualisiert.

Um große SVs (>1 MB Länge) zu identifizieren, haben wir die Chromosomen-Grade-Assembly (SP2271 und SP2273) mit dem SP1102-Referenzgenom abgeglichen, indem wir MUMMER mit den Parametern „--batch 1 -t 20 -l 100 -c 500“ verwendet haben. und die Ausrichtung mit den Parametern „-i 90 -l 100“ weiter gefiltert. SyRI v1.4 wurde übernommen, um SVs basierend auf den Alignment-Delta-Dateien zu identifizieren; Für die weitere Analyse wurden nur große SVs aufbewahrt. Wir haben die Hi-C-Interaktionskarte und den SV-Standort übernommen, um die großen SVs zu validieren. Von den 70 SVs, die in SP2271 und SP2273 identifiziert wurden, befinden sich 68 SVs in einem einzelnen Contig, was auf eine hohe Zuverlässigkeit schließen lässt. Davon konnten 40 SVs durch eine Hi-C-Interaktionskarte verifiziert werden.

Der assemblierungsbasierte Ansatz wurde angewendet, um SVs (> 40 bp lang) in S. americanum-Genomen nach der Pipeline von SVIM-asm78 zu identifizieren. Die Contig-Assemblys von SP2271, SP2273 und SP2275 wurden mithilfe von minimap2 (Ref. 76) mit den folgenden Parametern „--paf-no-hit -a -x asm5 --cs -r2k“ an der SP1102-Referenz ausgerichtet. SVs, die aus Einfügungen, Löschungen, Duplikationen und Inversionen bestehen, wurden mithilfe von SVIM-asm im „haploiden“ Modus identifiziert. Die SVs wurden von SnpEff79 weiter kommentiert.

Wir verwendeten die von SVIM-asm generierten SV-Informationen und eine Schiebefenstermethode (Fenster = 500 kb, Schritt = 50 kb), um die Sequenzdiversität im gesamten S. americanum-Genom zu berechnen. Die Diversität eines Fensters wurde wie folgt berechnet: Diversität = (Summe der SV-Länge in einem Fenster) / Fensterlänge. Der endgültige Diversitätswert jedes Fensters wurde aus dem Durchschnitt von SP2271, SP2273 und SP2275 generiert. Höhere Diversitätswerte beziehen sich auf höhere Variationsgrade eines Fensters. Wenn ein Fenster ein NLR-Gen überlappte, wurde dieses Fenster als NLR-Region gezählt und insgesamt 2.304 NLR-Regionen aus dem SP1102-Genom extrahiert. Um die Variationen zwischen NLR-Regionen und Nicht-NLR-Regionen zu vergleichen, haben wir zufällig 2.304 Nicht-NLR-Regionen ausgewählt und ihre Diversitätswerte mit denen für NLR-Regionen mittels Wilcoxon-Rangsummentest verglichen. Es wurden zehn Runden zufälliger Auswahl und Vergleiche zwischen Nicht-NRL-Regionen und NLR-Regionen durchgeführt.

Die NLR-Gene aus den vier Referenzgenomen von S. americanum wurden vom NLR-Annotator80 vorhergesagt. Um ein besseres Genmodell für diese NLR-Gene zu erhalten, wurden alle NLR-Gene aus den Genomen SP2271, SP1102 und SP2273 manuell kuratiert. Kurz gesagt, die Ausgaben des NLR-Annotators wurden in Geneious (v10.2.6) (Lit. 81) importiert, als Annotationen der Referenzgenome und die vorhergesagten NLR-Fragmente mit 2 kb flankierenden Sequenzen von beiden Seiten extrahiert wurden. Augustus66 wurde dann verwendet, um das Genmodell basierend auf dem trainierten Tomatendatensatz vorherzusagen. Die Genmodelle wurden auf der Grundlage funktionsvalidierter NLR-Gene aus öffentlichen Datenbanken kuratiert und cDNA-RenSeq-Daten wurden auch zur Unterstützung der manuellen Annotation verwendet.

Um auf die Phylogenie von NLRs zu schließen, wurden die mit dem NLR-Annotator gefundenen Proteinsequenzen für die NB-ARC-Domäne mit MAFFT71 abgeglichen und IQ-TREE zum Aufbau eines phylogenetischen Baums verwendet. Das JTT + F + R9-Substitutionsmodell wurde von ModelFinder82 ausgewählt und zur Ableitung des Maximum-Likelihood-Baums verwendet. Ultrafast Bootstrap (UFBoot)83 wurde auf 1.000 gesetzt. CED-4 von C. elegans wurde als Außengruppe ausgewählt.

Um das Vorhandensein und Fehlen von NLR in S. americanum-Genomen zu analysieren, haben wir 13 zuvor gemeldete SMRT RenSeq-Assemblys gesammelt und drei neue Assemblys aus den Akzessionen SP2298, SP3370 und SP2308 generiert. Der NLR-Annotator wurde verwendet, um die NLR-Gene im SMRT-RenSeq-Datensatz zu annotieren. Wir verwendeten GMAP84, um die NLR-Homologen zwischen den S. americanum-Genomen und SMRT-RenSeq-Assemblys vorherzusagen. Die CDS-Sequenzen manuell kuratierter NLRs im SP1102-Genom wurden extrahiert und mithilfe von GMAP mit den Parametern '-f 2 -n 1 --min-trimmed-coverage=0.70 --min' auf die drei S. americanum-Genome und 16 SMRT-RenSeq-Assemblys abgebildet -identität=0,70'. NLRs, die sich nicht ausrichten konnten, wurden als nicht vorhanden markiert. In der v4-RenSeq-Bibliothek85 waren im Vergleich zur v3-RenSeq-Bibliothek mehr Köder enthalten; Wenn also ein bestimmter NLR in allen v3-RenSeq-Assemblys fehlte, aber in v4-Assemblys vorhanden war, könnte das Fehlen ein falsch positives Ergebnis sein und wurde als NA markiert. Um das Expressionsniveau der NLR-Gene in SP1102 zu berechnen, wurde RNA aus jungen Blättern von SP1102 isoliert und cDNA-RenSeq wurde wie zuvor beschrieben86 durchgeführt. Wir haben die Lesevorgänge von SP1102 cDNA RenSeq mit STAR (2.6.0c) (Ref. 87) auf sein Genom abgebildet, die BAM-Dateien wurden in Geneious (v10.2.6) (Ref. 81) importiert und die TPM-Werte für NLR-Gene berechnet mithilfe der Funktion „Ausdrucksebenen berechnen“. Die NLR-Phylogenie-, TPM- und PAV-Ergebnisse wurden zur endgültigen Visualisierung an die Online-Software iTOL88 übergeben.

Die NLR-Proteinsequenzen aus 4 Genomassemblys sowie 16 SMRT-RenSeq-Assemblys wurden von OrthoFinder mithilfe des MCL-Algorithmus in Orthogruppen klassifiziert. Die Orthogruppenmatrix wurde dann mit PanGP (v.1.0.1) (Lit. 89) unter Verwendung des Zufallsalgorithmus verarbeitet. Die Parameter für Probengröße und Probenwiederholung wurden auf 500 bzw. 30 eingestellt. Diese Parameter geben an, dass bei jeder gegebenen Zugangsnummer (n) n Beitritte zufällig für die Pan- und Core-NLR-Analyse ausgewählt werden. Es wurde eine 500-fache Zufallsauswahl mit 30 Wiederholungen durchgeführt. Die geschätzte Größe von Pan- und Core-NLRomes wurde mit einem Boxplot dargestellt und mit Exponentialmodellen angepasst. Die Orthogruppen wurden entsprechend ihrer Häufigkeit des Auftretens in drei Kategorien eingeteilt: Kern (Orthogruppen in allen 18–20 Akzessionen vorhanden); entbehrlich (Orthogruppen, die in mehr als 3 Akzessionen übersehen wurden und in mindestens 2 Akzessionen vorhanden sind); und einzigartig (Orthogruppen sind nur in einer Akzession vorhanden). Für jeden Beitritt wurde die Anzahl der NLRs in verschiedenen Kategorien zusammengefasst und mit einem gestapelten Balkendiagramm dargestellt.

Die genomische DNA von 4 Wochen alten jungen Blättern von 52 Akzessionen von S. americanum wurde mit einem Qiagen DNeasy-Pflanzenkit (Qiagen, 69104) beprobt und isoliert. Eine PCR-freie, 2 × 150 bp große Paired-End-Illumina-Bibliothek für das gesamte Genom wurde von Novogene (Peking, China) generiert und sequenziert, wobei für jeden S. americanum-Beitritt etwa 10 GB Daten generiert wurden. Die Rohdaten wurden mit trimmomatic v0.36 (Ref. 90) getrimmt. Die sauberen Lesevorgänge jeder Akzession wurden mit minimap2 (v2.16) (Ref. 75) auf das SP1102-Referenzgenom abgebildet und mit samtools (v1.9) in das BAM-Format konvertiert. Der SNP-Aufruf wurde mit samtools und bcftools (v1.9) durchgeführt.

Um die phylogenetischen Beziehungen von S. americanum-Akzessionen abzuleiten, haben wir die Genome von Kartoffeln (DM 1-3 516 R44 v6.1), Tomaten (Heinz 1706 v4.0) und Auberginen (v3) als Fremdgruppe ausgewählt. Wgsim (https://github.com/lh3/wgsim) wurde verwendet, um Sequenzierungsablesungen des gesamten Genoms aus den Kartoffel-, Tomaten- und Auberginengenomen mit den Parametern zu simulieren: '-e 0 -d 350 -N 500000000 -1 150 -2 150 -r 0 -R 0 -X 0'. Die simulierte Lesezuordnung und der SNP-Aufruf wurden mit denselben Ansätzen durchgeführt. Bedtools (v2.17) wurde verwendet, um SNPs in kodierenden Regionen zu extrahieren. Der SNP-basierte phylogenetische Baum wurde von IQ-TREE mit UFBoot auf 1.000 und dem TVMe+R2-Best-Fit-Modell abgeleitet, das automatisch von ModelFinder ausgewählt wurde. Der phylogenetische Baum wurde mit FigTree (v1.4.4) visualisiert.

Für die GWAS-Analyse wurden alle SNPs, die sich in NLR-Genregionen befinden, sowie die 3-kb-Upstream- und 1-kb-Downstream-Regionen mit Bedtools (v2.17) extrahiert. Die SNPs wurden mit Plink (v1.90) mit den Parametern '--make-bed --allow-extra-chr --allow-no-sex --mind 1 --maf 0.05 -geno 0.05 --recode - gefiltert und verarbeitet. -aus'. Die Reaktionsfähigkeitswerte jedes Effektors wurden als Phänotyp verwendet und zur Assoziationsanalyse mit den Parametern „--allow-extra-chr --allow-no-sex --assoc --bfile --pheno“ an Plink übergeben. Der Manhattan-Plot wurde mit dem R-Paket qqman (v0.1.8) erstellt.

Im Effektoromik-Screening wurde eine RXLR-Effektorbibliothek mit 311 RXLR-Effektoren verwendet. Die Signalpeptide wurden entfernt und die Effektordomänen in Überexpressionsvektoren (pMDC32 oder pICSL86977) oder PVX-Vektoren kloniert. S. americanum-Pflanzen wurden in einem Sicherheitsgewächshaus gezüchtet. Für die Agroinfiltration wurden vier oder fünf Wochen alte Pflanzen verwendet. Für die Überexpressionsvektoren wurde der Zelltod bei 4 dpi bewertet; Für die PVX-Vektoren wurde der Zelltod bei 7 dpi bewertet. OD600 = 0,5. Der Zelltod-Phänotyp wurde bewertet (2, starke HR; 1, schwache HR; 0, keine HR). Für jedes Experiment wurden jeweils zwei Blätter von zwei Pflanzen verwendet.

Um die Kandidatengene zu verifizieren, wurde der ORF jedes Kandidatengens durch Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (NEB, M0530S) oder KAPA HiFi Uracil+ DNA-Polymerase (Roche, 07959052001) amplifiziert und dann mit dem 35S-Promotor in den Überexpressionsvektor pICLS86922 kloniert Ocs-Terminator unter Verwendung von BsaI (NEB, #R3733) oder eines USER-Klonierungsvektors (pICSLUS0004OD) mit dem 35S-Promotor und Ocs-Terminator unter Verwendung des USER-Enzyms (NEB, #M5508). Die verifizierten Konstrukte wurden zur vorübergehenden Expression in Pflanzen in Agrobacterium transformiert.

Für die Knockout-Konstrukte wurden Guide-RNAs in Geneious (v10.2.6) unter Verwendung der Funktion „Find CRISPR Site“ mit folgenden Parametern entworfen: „Maximal zulässige Fehlpaarungen gegen Off-Targets = 3; Die maximal zulässigen Abweichungen betragen indels = 0; Paar CRISPR-Sites: Maximale Überlappung gepaarter Sites = 100; Maximal zulässiger Platz zwischen gepaarten Standorten = 300 Fuß. Das Referenzgenom oder die SMRT-RenSeq-Assemblierung wurde zur Bewertung der Off-Target-Aktivität verwendet. Die ausgewählten Leit-RNAs sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Zwei Leit-RNAs für jedes Kandidatengen wurden mit dem sgRNA-Gerüst durch Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase (NEB, M0491S) amplifiziert und der pICSL70001-Vektor wurde als Matrize verwendet. Die Fragmente wurden dann mit einem Arabidopsis U6-26-Promotor (pICL90002) fusioniert und an verschiedenen Positionen in Level-1-Vektoren kloniert (Position 3, pICH47751; Position 4, pICH47761; Position 5, pICH47772; Position 6, pICH47772). Für die endgültigen Level-2-Konstrukte wurden Cas9 mit Introns (Position 1, pICSL11197), NPTII (Position 2, pICSL11055), ein Endlinker (pICH41922) und die Guide-RNAs zu pICSL4723_OD zusammengesetzt. Die endgültigen Konstrukte wurden dann durch Gen-Knockout in S. americanum-Akzessionen umgewandelt. Nach der Transformation wurden die T0-Linien zur Phänotypisierung und Genotypisierung in ein Sicherheitsgewächshaus gebracht. Zur Phänotypisierung wurde die Agroinfiltration des entsprechenden Effektors genutzt. Genomische DNA aus den einzelnen T0-Linien wurde isoliert und spezifische Primer für das Cas9-Gen und die Zielgene entworfen. Amplikons aus den Zielgenen wurden zur Sequenzierung in den pGEM-Teasy TA-Klonierungsvektor (Promega, A1360) oder pICSL86977 subkloniert. Die Sequenzierungsdaten wurden in Geneious (v10.2.6) analysiert.

Die N. benthamiana und N. tabacum cv. Petit Gerard-Pflanzen wurden in einem Raum mit kontrollierter Umgebung (CER) bei 22 °C und 45–65 % Luftfeuchtigkeit mit einer 16-stündigen Photoperiode gesät und gezüchtet. Für den HR-Test wurden vier Wochen alte Pflanzen verwendet.

Für die S. americanum-Transformation wurden sterilisierte Samen (SP2271 und SP2300) in MS-Medium (2 % Saccharose) ausgesät. Von 4 bis 6 Wochen alten In-vitro-Pflanzen wurden Blattscheiben geschnitten. Übernachtkultur von Agrobacterium (AGL1) (100 µl) und 200 µM Acetosyringon wurden zu 20 ml LSR-Brühe gegeben und die Blattscheiben wurden vorsichtig 20 Minuten lang mit einer sterilen Pinzette in die Lösung getaucht. Anschließend wurden die Blattscheiben aus der Agrobacterium-Suspension entnommen, trockengetupft und drei Tage lang bei schwachem Licht bei 18–24 °C inkubiert. Die getrockneten Blattscheiben wurden auf LSR1 + 200 µM Acetosyringon-Festmedium ausplattiert. Cokultivierte Explantate wurden in Petrischalen mit Selektionsantibiotika auf LSR1-Medium übertragen (etwa sieben Blattscheiben pro Platte). Die Explantate wurden etwa alle 14 Tage auf frischem LSR1-Medium subkultiviert. Sobald die Kalli ausreichend entwickelt waren, wurden sie auf LSR2-Medium übertragen. Die Subkultivierung wurde alle 14 Tage fortgesetzt, sobald Triebe zu erscheinen begannen. Die Triebe wurden mit einem scharfen Skalpell entfernt und in festes MS2R-Medium mit Selektionsantibiotika gepflanzt. Transgene Pflanzen, die über entsprechende Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene verfügen, sollten in der vierten Woche normal Wurzeln schlagen und können dann aus der Gewebekultur in sterile Torfblöcke entwöhnt werden, bevor sie in das Gewächshaus überführt werden. Die verwendeten Medien hatten die folgenden Komponenten: LSR-Brühe (1 × MS-Medium, 3 % Saccharose, pH 5,7); LSR1-Medium (1× MS-Medium, 3 % Saccharose, 2,0 mg L-1-Zeatinribosid, 0,2 mg L-1 NAA, 0,02 mg L-1 GA3, 0,6 % Agarose, pH 5,7); LSR2-Medium (1× MS-Medium, 3 % Saccharose, 2,0 mg L-1-Zeatinribosid, 0,02 mg L-1 GA3, 0,6 % Agarose, pH 5,7); MS2R (1× MS-Medium, 2 % Saccharose, 100 mg L-1-Myo-Inositol, 2,0 mg L-1-Glycin, 0,2 % Gelrite, pH 5,7).

Die P. infestans-Isolate T30-4 und 88069 wurden für den Krankheitstest verwendet und auf Roggen-Saccharose-Agar-Medium (RSA) in einem Inkubator bei 18 °C gehalten. Um Zoosporen zu induzieren, wurde nach 10–14 Tagen eiskaltes Wasser auf die Platten gegeben. Anschließend wurden die Platten 1–2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert und mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zoosporen gezählt. Für die DLA wurde die Zoosporensuspension verwendet (100–500 Zoosporen pro Tropfen).

In dieser Studie wurden drei Kartierungspopulationen verwendet: (1) F2-Populationen von SP2271 × SP2272 und (2) BC1- und (3) F2-Populationen von SP2271 × SP2300. Die Populationen wurden durch Agroinfiltration von RXLR-Effektoren phänotypisiert. Für die Probenahme wurde ein Korkbohrer verwendet und die Blattscheiben der reagierenden und nicht reagierenden Nachkommen wurden gepoolt. Die genomische DNA wurde mit dem Qiagen DNeasy Plant Kit (Qiagen, 69104) isoliert. Anschließend wurden RenSeq-Bibliotheken wie zuvor beschrieben24 vorbereitet. Die Bibliotheken wurden von Novogene (Peking, China) sequenziert (Illumina 2 × 250-bp-Reads). Die SNP-Filter- und Aufrufschritte wurden zuvor beschrieben26.

Um molekulare Marker zu entwerfen, wurden die 10-fachen PCR-freien Resequenzierungsablesungen auf das SP2271 S. americanum-Referenzgenom abgebildet. Anschließend wurden SCAR-Marker entworfen, die mit den BSA-RenSeq-Signalen verknüpft waren. Amplikons sollten nur im nicht reagierenden Allel vorhanden sein. Die SCAR-Marker wurden zunächst an den Elternlinien getestet und die verifizierten Marker wurden dann an der genomischen DNA einzelner nicht reagierender Pflanzen verwendet. Zur Genotypisierung wurde GoTaq G2 DNA-Polymerase (Promega, 0000066542) verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die rohen Sequenzierungsdaten und Genomassemblierungen der Genomen SP1102, SP2271, SP2273 und SP2275 wurden im Sequence Read Archive (SRA) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) mit der BioProject-Zugangsnummer PRJNA845062 hinterlegt; Die rohen SMRT RenSeq-Daten wurden bei ENA unter der Projektnummer PRJEB38240 hinterlegt. Die Daten zur Neusequenzierung des gesamten Genoms wurden bei ENA unter der Projektnummer PRJEB57057 hinterlegt. Die BSA-RenSeq-Daten wurden bei ENA unter den Projektnummern PRJEB57070 und PRJEB57074 hinterlegt. Die zusammengestellten Genome, Genstrukturanmerkungen, SMRT-RenSeq-Assemblys und manuell annotierten NLR-Gene sowie Variationsinformationen sind bei Figshare verfügbar (https://figshare.com/projects/The_Solanum_americanum_pangenome_and_effectoromics_reveals_new_resistance_genes_against_potato_late_blight/145449). Die Sequenzen SaNRC1-1102, SaNRC2-1102, SaNRC3-1102, Rpi-amr4-1102, Rpi-amr4-2271, R02860 (Rpi-amr16) und R04373 (Rpi-amr17) wurden bei NCBI GenBank unter der Zugangsnummer OP918030–OP918036 hinterlegt . Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Benutzerdefinierte Skripte und Codes, die in dieser Studie verwendet werden, sind bei Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7928678)91 verfügbar.

Savary, S. et al. Die weltweite Belastung wichtiger Nahrungspflanzen durch Krankheitserreger und Schädlinge. Nat. Ökologisch. Entwicklung 3, 430–439 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Fry, W. Phytophthora infestans: der Pflanzen- (und R-Gen-)Zerstörer. Mol. Pflanzenpathol. 9, 385–402 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lokossou, AA et al. Nutzung des Wissens über R/Avr-Gene zur schnellen Klonierung einer neuen LZ-NBS-LRR-Familie von Krautfäule-Resistenzgenen aus der Kartoffelverknüpfungsgruppe IV. Mol. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 22, 630–641 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, S. et al. Vergleichende Genomik ermöglichte die Isolierung des R3a-Spätfäule-Resistenzgens in Kartoffeln. Pflanze J. 42, 251–261 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vossen, JH et al. Das Solanum demissum R8-Spätfäule-Resistenzgen ist ein Sw-5-Homolog, das weltweit in Sorten eingesetzt wird, die gegen Kraut- und Knollenfäule resistent sind. Theor. Appl Genet 129, 1785–1796 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Song, J. et al. Das aus Solanum Bulbocastanum geklonte Gen RB verleiht ein breites Spektrum an Resistenz gegen Kraut- und Knollenfäule der Kartoffel. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 100, 9128–9133 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vossen, E. et al. Ein altes R-Gen der Wildkartoffelart Solanum Bulbocastanum verleiht Kulturkartoffeln und Tomaten eine Breitbandresistenz gegen Phytophthora infestans. Plant J. 36, 867–882 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

van der Vossen, EAG et al. Das Rpi-blb2-Gen aus Solanum Bulbocastanum ist ein Mi-1-Genhomolog, das Kartoffeln eine Breitbandresistenz gegen Kraut- und Knollenfäule verleiht. Pflanze J. 44, 208–222 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Foster, SJ et al. Rpi-vnt1.1, ein Tm-22-Homolog aus Solanum venturii, verleiht Resistenz gegen die Kartoffelfäule. Mol. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 22, 589–600 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pel, MA et al. Kartierung und Klonierung von Krautfäule-Resistenzgenen aus Solanum venturii unter Verwendung eines interspezifischen Kandidatengen-Ansatzes. Mol. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 22, 601–615 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Haas, BJ et al. Genomsequenzierung und Analyse des irischen Hungersnoterregers Phytophthora infestans. Natur 461, 393–398 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vleeshouwers, VGAA et al. Verständnis und Nutzung der Kraut- und Knollenfäuleresistenz im Zeitalter der Effektoren. Annu. Rev. Phytopathol. 49, 507–531 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, X. et al. Genomsequenzierung und Analyse der Knollenfruchtkartoffel. Natur 475, 189–195 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tomatengenom-Konsortium. Die Genomsequenz der Tomate liefert Einblicke in die Entwicklung fleischiger Früchte. Natur 485, 635–641 (2012).

Artikel Google Scholar

Wei, Q. et al. Eine hochwertige Genomassemblierung auf Chromosomenebene enthüllt die Genetik wichtiger Merkmale von Auberginen. Hortisch. Res. 7, 153 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, S. et al. Die Genomsequenz der scharfen Paprika liefert Einblicke in die Entwicklung der Schärfe bei Capsicum-Arten. Nat. Genet. 46, 270–278 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou, Q. et al. Haplotyp-aufgelöste Genomanalysen einer heterozygoten diploiden Kartoffel. Nat. Genet. 52, 1018–1023 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, H. et al. Chromosomen- und Haplotyp-aufgelöste Genomassemblierung einer tetraploiden Kartoffelsorte. Nat. Genet. 54, 342–348 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoopes, G. et al. Phasenweise, chromosomenskalige Genomassemblierungen tetraploider Kartoffeln offenbaren eine komplexe Genom-, Transkriptom- und vorhergesagte Proteomlandschaft, die der genetischen Vielfalt zugrunde liegt. Mol. Pflanze https://doi.org/10.1016/j.molp.2022.01.003 (2022).

Zhao, Q. et al. Die Pangenomanalyse verdeutlicht das Ausmaß der genomischen Variation bei Kultur- und Wildreis. Nat. Genet. 50, 278–284 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, Y. et al. Pangenom wilder und kultivierter Sojabohnen. Zelle 182, 162–176 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gao, L. et al. Das Tomaten-Pan-Genom deckt neue Gene und ein seltenes Allel auf, das den Fruchtgeschmack reguliert. Nat. Genet. 51, 1044–1051 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tang, D. et al. Genomentwicklung und Vielfalt von Wild- und Kulturkartoffeln. Natur 606, 535–541 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Justus, F. et al. Die Resistenzgenanreicherungssequenzierung (RenSeq) ermöglicht die Neuannotation der NB-LRR-Genfamilie aus sequenzierten Pflanzengenomen und die schnelle Kartierung von Resistenzorten in segregierenden Populationen. Plant J. 76, 530–544 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Witek, K. et al. Beschleunigtes Klonen eines Kartoffelfäule-Resistenzgens mithilfe von RenSeq und SMRT-Sequenzierung. Nat. Biotechnologie. 34, 656–660 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lin, X. et al. RLP/K-Anreicherungssequenzierung; eine neuartige Methode zur Identifizierung von Rezeptor-ähnlichen Proteinen (RLP) und Rezeptor-ähnlichen Kinase-Genen (RLK). Neues Phytol. 227, 1264–1276 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arora, S. et al. Klonen von Resistenzgenen aus einem Wildpflanzenverwandten durch Sequenzerfassung und Assoziationsgenetik. Nat. Biotechnologie. 37, 139–143 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Van de Weyer, A.-L. et al. Ein artweites Inventar der NLR-Gene und -Allele in Arabidopsis thaliana. Zelle 178, 1260–1272 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Witek, K. et al. Ein komplexer Resistenzort in Solanum americanum erkennt einen konservierten Phytophthora-Effektor. Nat. Pflanzen 7, 198–208 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, X. et al. Ein Kartoffelfäule-Resistenzgen schützt vor mehreren Phytophthora-Arten, indem es einen breit konservierten RXLR-WY-Effektor erkennt. Mol. Werk 15, 1457–1469 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lin, X. et al. Identifizierung von Avramr1 aus Phytophthora infestans mittels Long-Read- und cDNA-Pathogen-Anreicherungssequenzierung (PenSeq). Mol. Pflanzenpathol. 21, 1502–1512 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, C. et al. Genomdesign einer Hybridkartoffel. Zelle 184, 3873–3883 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moon, H. et al. Identifizierung von RipAZ1 als Avirulenzdeterminante von Ralstonia solanacearum in Solanum americanum. Mol. Pflanzenpathol. 22, 317–333 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Särkinen, T., Bohs, L., Olmstead, RG & Knapp, S. Ein phylogenetischer Rahmen für die evolutionäre Untersuchung der Nachtschattengewächse (Solanaceae): ein datierter Baum mit 1000 Spitzen. BMC Evol. Biol. 13, 214 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rieseberg, L. Chromosomenumlagerungen und Artbildung. Trends Ecol. Entwicklung 16, 351–358 (2001).

Yuan, Y., Bayer, PE, Batley, J. & Edwards, D. Aktueller Stand der Strukturvariationsstudien in Pflanzen. Pflanzenbiotechnologie. J. 19, 2153–2163 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Barragan, AC & Weigel, D. Pflanzen-NLR-Diversität: die bekannten Unbekannten pan-NLRomes. Pflanzenzelle 33, 814–831 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, C.-H. et al. Das NLR-Netzwerk vermittelt Immunität gegen verschiedene Pflanzenpathogene. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 114, 8113–8118 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adachi, H. et al. Ein atypisches NLR-Protein moduliert das NRC-Immunrezeptornetzwerk in Nicotiana benthamiana. PLoS Genet. 19, e1010500 (2023).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, L. et al. Ein Anfälligkeitsfaktor ist das Kartoffel-NPH3/RPT2-ähnliche Protein StNRL1, auf das ein RXLR-Effektor von Phytophthora infestans abzielt. Pflanzenphysiologie. 171, 645–657 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sangija, F., Martin, H. & Matemu, A. Afrikanische Nachtschattengewächse (Solanum nigrum complex): der potenzielle Beitrag zur menschlichen Ernährung und zum Lebensunterhalt in Afrika südlich der Sahara. Kompr. Rev. Food Sci. Lebensmittelecht. 20, 3284–3318 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Laflamme, B. et al. Die durch Pan-Genom-Effektoren ausgelöste Immunitätslandschaft einer Wirt-Pathogen-Interaktion. Wissenschaft 367, 763–768 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rietman, H. Einsatz der Genomsequenz von Phytophthora infestans: Mehrere neue Kandidaten für Avirulenz- und Kartoffelresistenzgene entdeckt. Doktorarbeit (Universität Wageningen, 2011).

Oh, S.-K. et al. In Planta-Expressionsscreenings von Phytophthora infestans RXLR-Effektoren zeigen sich verschiedene Phänotypen, einschließlich der Aktivierung des Solanum-bulbocastanum-Krankheitsresistenzproteins Rpi-blb2. Pflanzenzelle 21, 2928–2947 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vleeshouwers, VGAA & Oliver, RP Effektoren als Werkzeuge bei der Züchtung von Krankheitsresistenzen gegen biotrophe, hemibiotrophe und nekrotrophe Pflanzenpathogene. Mol. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 27, 196–206 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pais, M. et al. Genexpressionspolymorphismus untermauert die Umgehung der Wirtsimmunität in einer asexuellen Abstammungslinie des Erregers der irischen Hungersnot. BMC Evol. Biol. 18, 93 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, S., Li, Y., Vossen, JH, Visser, RGF & Jacobsen, E. Funktionelle Stapelung von drei Resistenzgenen gegen Phytophthora infestans in Kartoffeln. Transgene Res. 21, 89–99 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ghislain, M. et al. Die direkte Einbringung von drei Resistenzgenen gegen Kraut- und Knollenfäule aus Wildarten in afrikanische Hochlandkartoffelsorten führt zu einer vollständigen Feldresistenz gegen lokale Kraut- und Knollenfäulerassen. Pflanzenbiotechnologie. J. 17, 1119–1129 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Derevnina, L. et al. Pflanzenpathogene entwickelten sich konvergent, um redundanten Knoten eines NLR-Immunrezeptornetzwerks entgegenzuwirken. PLoS Biol. 19, e3001136 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mapleson, D., Garcia Accinelli, G., Kettleborough, G., Wright, J. & Clavijo, BJ KAT: ein K-mer-Analyse-Toolkit zur Qualitätskontrolle von NGS-Datensätzen und Genomassemblierungen. Bioinformatik 33, 574–576 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ranallo-Benavidez, TR, Jaron, KS & Schatz, MC GenomeScope 2.0 und Smudgeplot für die referenzfreie Profilierung polyploider Genome. Nat. Komm. 11, 1432 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng, H., Concepcion, GT, Feng, X., Zhang, H. & Li, H. Haplotyp-aufgelöste De-novo-Assemblierung unter Verwendung von Phased-Assembly-Graphen mit Hifiasmus. Nat. Meth.18, 170–175 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Koren, S. et al. Canu: Skalierbare und genaue Long-Read-Assemblierung durch adaptive K-Mer-Gewichtung und Wiederholungstrennung. Genomres. 27, 722–736 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, H., Wu, S., Li, A. & Ruan, J. SMARTdenovo: ein De-novo-Assembler, der lange, verrauschte Lesevorgänge verwendet. GigaByte https://doi.org/10.46471/gigabyte.15 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. & Durbin, R. Schnelle und genaue Ausrichtung kurzer Lesevorgänge mit der Burrows-Wheeler-Transformation. Bioinformatik 25, 1754–1760 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walker, BJ et al. Pilon: ein integriertes Tool zur umfassenden Erkennung mikrobieller Varianten und zur Verbesserung der Genomassemblierung. PLoS ONE 9, e112963 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Durand, NC et al. Juicer bietet ein Ein-Klick-System zur Analyse von Hi-C-Experimenten mit Schleifenauflösung. Zellsystem 3, 95–98 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dudchenko, O. et al. Die De-novo-Assemblierung des Aedes aegypti-Genoms unter Verwendung von Hi-C ergibt Gerüste mit Chromosomenlänge. Wissenschaft 356, 92–95 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simão, FA, Waterhouse, RM & Ioannidis, P. BUSCO: Bewertung der Genomassemblierung und Annotationsvollständigkeit mit Einzelkopie-Orthologen. Bioinformatik 31, 3210–3212 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Kim, D., Langmead, B. & Salzberg, SL HISAT: ein schnell gespleißter Aligner mit geringem Speicherbedarf. Nat. Meth. 12, 357–360 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Pertea, M. et al. StringTie ermöglicht eine verbesserte Rekonstruktion eines Transkriptoms aus RNA-seq-Reads. Nat. Biotechnologie. 33, 290–295 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roberts, A. et al. Differenzielle Gen- und Transkriptexpressionsanalyse von RNA-seq-Experimenten mit TopHat und Cufflinks. Nat. Protokoll. 7, 562–578 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Grabherr, MG et al. Vollständige Transkriptomassemblierung aus RNA-Seq-Daten ohne Referenzgenom. Nat. Biotechnologie. 29, 644–652 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haas, BJ et al. Automatisierte Annotation der eukaryotischen Genstruktur mit EVidenceModeler und dem Programm zum Zusammenstellen gespleißter Alignments. Genombiol. 9, R7 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Korf, I. Genfindung in neuartigen Genomen. BMC Bioinforma. 5, 59 (2004).

Artikel Google Scholar

Stanke, M. & Morgenstern, B. AUGUSTUS: ein Webserver zur Genvorhersage in Eukaryoten, der benutzerdefinierte Einschränkungen ermöglicht. Nukleinsäuren Res. 33, W465–W467 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Majoros, WH, Pertea, M. & Salzberg, SL TigrScan und GlimmerHMM: zwei Open-Source-Ab-initio-Genfinder für eukaryotische Gene. Bioinformatik https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bth315 (2004).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Slater, GSC & Birney, E. Automatisierte Generierung von Heuristiken für den Vergleich biologischer Sequenzen. BMC Bioinformatik. 6, 31 (2005).

Artikel Google Scholar

Keilwagen, J., Hartung, F., Paulini, M., Twardziok, SO & Grau, J. Kombination von RNA-seq-Daten und homologiebasierter Genvorhersage für Pflanzen, Tiere und Pilze. BMC Bioinformatik. 19, 189 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Emms, DM & Kelly, S. OrthoFinder: Die Lösung grundlegender Verzerrungen bei Gesamtgenomvergleichen verbessert die Genauigkeit der Orthogruppen-Inferenz erheblich. Genombiol. 16, 157 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K. & Standley, DM MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Verbesserungen bei Leistung und Benutzerfreundlichkeit. Mol. Biol. Entwicklung 30, 772–780 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Minh, BQ et al. IQ-TREE 2: Neue Modelle und effiziente Methoden zur phylogenetischen Inferenz im genomischen Zeitalter. Mol. Biol. Entwicklung 37, 1530–1534 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, Z. PAML 4: Phylogenetische Analyse nach Maximum Likelihood. Mol. Biol. Entwicklung 24, 1586–1591 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marçais, G. et al. MUMmer4: ein schnelles und vielseitiges Genom-Alignment-System. PLoS Comput. Biol. 14, e1005944 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. Minimap2: Paarweise Ausrichtung für Nukleotidsequenzen. Bioinformatik 18, 3094–3100 (2018).

Artikel Google Scholar

Cabanettes, F. & Klopp, C. D-GENIES: Punktplot großer Genome auf interaktive, effiziente und einfache Weise. PeerJ 6, e4958 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. MCScanX: ein Toolkit zur Erkennung und evolutionären Analyse der Syntenie und Kollinearität von Genen. Nukleinsäuren Res. 40, e49 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heller, D. & Vingron, M. SVIM-asm: Strukturvariantenerkennung aus haploiden und diploiden Genomanordnungen. Bioinformatik https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btaa1034 (2020).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Cingolani, P. et al. Ein Programm zur Annotation und Vorhersage der Auswirkungen von Einzelnukleotidpolymorphismen, SnpEff: SNPs im Genom des Drosophila melanogaster-Stamms w1118; ISO-2; ISO-3. Fliege 6, 80–92 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steuernagel, B. et al. Das NLR-Annotator-Tool ermöglicht die Annotation des intrazellulären Immunrezeptor-Repertoires. Pflanzenphysiologie. 183, 468–482 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kearse, M. et al. Geneious Basic: eine integrierte und erweiterbare Desktop-Softwareplattform für die Organisation und Analyse von Sequenzdaten. Bioinformatik 28, 1647–1649 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalyaanamoorthy, S., Minh, BQ, Wong, TKF, von Haeseler, A. & Jermiin, LS ModelFinder: schnelle Modellauswahl für genaue phylogenetische Schätzungen. Nat. Meth. 14, 587–589 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Hoang, DT, Chernomor, O., von Haeseler, A., Minh, BQ & Vinh, LS UFBoot2: Verbesserung der ultraschnellen Bootstrap-Näherung. Mol. Biol. Entwicklung 35, 518–522 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, TD & Watanabe, CK GMAP: ein genomisches Kartierungs- und Alignment-Programm für mRNA- und EST-Sequenzen. Bioinformatik 21, 1859–1875 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Seong, K., Seo, E., Witek, K., Li, M. & Staskawicz, B. Evolution von NLR-Resistenzgenen mit nichtkanonischen N-terminalen Domänen in wilden Tomatenarten. Neues Phytol. 227, 1530–1543 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Andolfo, G. et al. Definition des gesamten NB-LRR-Resistenzgenrepertoires der Tomate mithilfe von genomischem und cDNA-RenSeq. BMC Plant Biol. 14, 120 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobin, A. et al. STAR: ultraschneller universeller RNA-seq-Aligner. Bioinformatik 29, 15–21 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: ein Online-Tool für die Anzeige und Annotation phylogenetischer Bäume. Nukleinsäuren Res. 49, W293–W296 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, Y. et al. PanGP: ein Tool zur schnellen Analyse des bakteriellen Pangenomprofils. Bioinformatik 30, 1297–1299 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30, 2114–2120 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jia Y. Codes of Solanum americanum genomgestützte Entdeckung von Immunrezeptoren, die Effektoren von Krankheitserregern der Kartoffelfäule erkennen. Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.7928678 (2023).

Referenzen herunterladen

Diese Forschung wurde durch BBSRC-Zuschüsse BB/P021646/1 (JDGJ), BB/S018832/1 (JDGJ), BB/W017423/1 (JDGJ), die Gatsby Charitable Foundation (JDGJ) und das National Key Research and Development Program of China finanziert (2019YFA0906200, SH), Guangdong Major Project of Basic and Applied Basic Research (2021B0301030004, SH), Agricultural Science and Technology Innovation Program (CAAS-ZDRW202101, SH), Shenzhen Outstanding Talents Training Fund (SH), National Research Foundation of Korea ( 2018R1A5A1023599 und 2023R1A2C3002366, KHS) und New Breeding Technologies Development Program (PJ015799 und PJ016538, SJP). Wir danken dem TSL-Transformationsteam (A. Wawryk-Khamdavong), dem SynBio-Team (M. Youles und L. Egan), den Mediendiensten (N. Stammars), dem Bioinformatik-Team (D. MacLean und C. Jégousse) und dem Gartenbauteam (S. Perkins, J. Smith, L. Phillips, C. Taylor, T. Wells, D. Alger und S. Able) für ihre Unterstützung. Wir danken P. Robinson (JIC) für die wissenschaftliche Fotografie. Wir danken S. Marillonnet (Icon Genetics GmbH, Halle/Saale, Deutschland) für die Bereitstellung des Cas9-Konstrukts (pAGM47523). Wir danken Experimental Garden und Genebank der Radboud University, Nijmegen, Niederlande, IPK Gatersleben, Deutschland und S. Knapp (Natural History Museum, London, UK) für den Zugang zur genetischen Vielfalt von S. americanum. Wir danken VGAA Vleeshouwers von der Wageningen University and Research, P. Birch, I. Hein und B. Harrower vom James Hutton Institute für die Bereitstellung von Klonen einiger Effektoren. Wir danken BBH Wulff, S. Arora und K. Gaurav (JIC) für hilfreiche Diskussionen.

Maxim Proktschortschik

Aktuelle Adresse: Plant Pathology Group, Institut für Nutzpflanzenwissenschaften und Ressourcenschutz, Universität Bonn, Bonn, Deutschland

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xiao Lin, Yuxin Jia.

Das Sainsbury Laboratory, University of East Anglia, Norwich Research Park, Norwich, Großbritannien

Xiao Lin, Robert Heal, Maria Sindalovskaya, Andrea Olave-Achury, Moffat Makechemu, Sebastian Fairhead, Azka Noureen, Kamil Witek, Matthew Smoker, Jodie Taylor, Ram-Krishna Shrestha und Jonathan DG Jones

Staatliches Schlüssellabor für Pflanzengenomik, Institut für Mikrobiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China

Xiao Lin

Zweigstelle Shenzhen, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Labor für Genomanalyse des Ministeriums für Landwirtschaft und ländliche Gebiete, Institut für Agrargenomik in Shenzhen, Chinesische Akademie der Agrarwissenschaften, Shenzhen, China

Yuxin Jia, Chunzhi Zhang und Sanwen Huang

Schlüssellabor für Kartoffelbiologie der Provinz Yunnan, Gemeinsame Akademie für Kartoffelwissenschaft CAAS-YNNU-YINMORE, Yunnan Normal University, Kunming, China

Yuxin Jia

Abteilung für Biowissenschaften, Pohang University of Science and Technology, Pohang, Republik Korea

Maxim Prokchorchik, Yoonyoung Lee & Kee Hoon Sohn

Abteilung für Biowissenschaften und Institut für Grundlagenwissenschaften, Wonkwang-Universität, Iksan, Republik Korea

Jung Heo & Soon Ju Park

Abteilung für angewandte Biowissenschaften und Forschungszentrum für Molekularbiologie und Biotechnologie von Pflanzen (PMBBRC), Gyeongsang National University, Jinju, Republik Korea

Bald Ju Park

School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology, Pohang, Republik Korea

Kee Hoon Sohn

Abteilung für Agrarbiotechnologie, Seoul National University, Seoul, Republik Korea

Kee Hoon Sohn

Plant Immunity Research Center, Seoul National University, Seoul, Republik Korea

Kee Hoon Sohn

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XLYJ, KHS, SH und JDGJ konzipierten und gestalteten das Projekt. XL und YJ haben den ersten Entwurf mit Beiträgen aller Autoren geschrieben. XL, YJ, KHS, SH und JDGJ haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. YJ, MP, XL, RKS und JH führten die bioinformatischen Analysen durch. XL und MM führten das Effektoromik-Screening durch. XL, RH, MS, ACOA, SF und AN trugen zur Klonierung und Charakterisierung von Rpi-amr4, R02860 und R04373 bei. M. Smoker und JT führten die Pflanzentransformation durch. KW, YL, CZ, SJP, KHS, SH und JDGJ haben Ressourcen beigesteuert.

Korrespondenz mit Xiao Lin, Kee Hoon Sohn, Sanwen Huang oder Jonathan DG Jones.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Genetics dankt Doil Choi, Xiu-Fang Xin und Jack H. Vossen für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Anmerkungen 1–3 und Abbildungen. 1–19.

Ergänzende_Tabellen

Phylogenetische Verwandtschaft von S. americanum und benachbarten Arten; Genomsyntenie von S. americanum, Kartoffel und Aubergine.

Die Messung der Läsionsgröße.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lin, X., Jia, Y., Heal, R. et al. Solanum americanum genomgestützte Entdeckung von Immunrezeptoren, die Effektoren von Krankheitserregern der Kraut- und Knollenfäule der Kartoffel erkennen. Nat Genet (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01486-9

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Eingegangen: 12. August 2022

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01486-9

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